CRISPR/Cas9 の代謝工学の可能性を解き放つ DNA アセンブリ ツールキット

Communications Biology volume 6、記事番号: 858 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

CRISPR/Cas9 ベースのテクノロジーは、微生物細胞を操作する方法に革命をもたらしています。 株設計における CRISPR の重要な利点の 1 つは、マーカーのない DNA の染色体への組み込みを可能にし、面倒で非効率なことが多いマーカー回収手順を排除できることです。 このような利点にもかかわらず、CRISPR/Cas9 編集システムの組み立ては依然として簡単なプロセスではなく、その使用や応用が妨げられる可能性があります。 この作業では、現在の Cas9 ツールキットの主な制限のいくつかを特定し、CRISPR テクノロジーへのアクセスと実装を容易にすることを目的とした改善を設計しました。 これらには、1) Cre 発現大腸菌株と標準大腸菌株の両方を使用してマーカーフリー組み込みコンストラクトとマーカーベース組み込みコンストラクトを迅速に切り替えるシステム、2) ゴールデン ゲート ベースの交換を介して複数遺伝子組み込みカセットを別のゲノム遺伝子座にリダイレクトする機能が含まれます。 3) Cas9 ヘルパー プラスミドと単一のオリゴヌクレオチド間の組換えを介してガイド RNA 配列を構築するための迅速かつ簡単な in vivo 方法。 私たちは、これらの方法論と確立された技術を組み合わせて、CRISPR/Cas9 を使用した効率的な代謝工学のための包括的なツールキットを作成します。 概念実証として、Yarrowia liplytica 用の YaliCraft ツールキットを開発しました。これは、147 個のプラスミドの基本セットと、さまざまな目的を持つ 7 個のモジュールで構成されています。 このツールキットを使用して、137 個のプロモーターのライブラリーを生成および特性評価し、373.8 mg/L のホモゲンチシン酸を合成する de novo 株を構築しました。

CRISPR/Cas9 ベースの技術の開発により、迅速、正確、傷跡のないゲノム改変が可能になり、微生物株の設計と生物生産に大きな可能性が示されています。 特に、酵母の代謝工学は生物学工学の中で最も急速に成長している分野の 1 つであり、化学物質、燃料、材料、食品、医薬品の持続可能な生産を可能にします1。 酵母は、真核細胞の大きな代謝能力を備えていますが、単一細胞の性質と急速な増殖により、操作や大規模培養が容易です。

そのため、CRISPR システムは酵母用に開発されました 2、3、4。 CRISPR の最も重要な利点の 1 つは、その高い効率によりマーカーレスのゲノム修飾が可能であることです。 従来の菌株操作では、マーカー回収として知られるゲノムからの選択可能なマーカーの除去が一般的なボトルネックとなっています5。 急速に増殖する酵母培養でもマーカーの回収には少なくとも 5 日かかります 6 が、統合的形質転換自体には 2 ～ 3 日しかかかりません。 したがって、過去数年間に、CRISPR によって促進されるいくつかのマーカーフリー統合技術が開発されました 6、7、8、9。 これらの発展にもかかわらず、現在の代謝工学プロジェクトの多くは依然としてマーカーベースのアプローチに依存しており、これにより菌株の最適化の成功が制限されたり遅れたりする可能性があります。 この研究では、Cas9 ベースの酵母工学の使用を促進する可能性のある CRISPR/Cas9 システムの 3 つの改善点を特定しました。(1) マーカー修飾とマーカーなし修飾の間の簡単な交換 (2) 異なる組込みをターゲットとする相同性アームの迅速な交換(3) gRNA をクローニングする簡単な方法。

CRISPR ベースのマーカーフリー組み込みにおける唯一の選択因子は、Cas9 によって誘導される二本鎖切断 (DSB) です。 細胞が増殖するには、この損傷を修復する必要があります。 これは、相同組換え (HR) を介して統合されるテンプレート (ドナー) を使用することによって、または非相同末端結合 (NHEJ) によって、つまり統合なしで行われる可能性があります。 NHEJ 活性は、パン酵母 Saccharomyces cerevisiae を含むほとんどの真菌種で観察されます 5,10。 NHEJ が主要なメカニズムである種では、HR を増強するための一般的な戦略は、NHEJ 遺伝子 (KU70、KU80、POL4、および DNL4) を削除することです 11。 この戦略は、HR を改善する一方で、望ましくない NHEJ 活動を完全に防止するものではありません 12。 したがって、遅い増殖表現型をもたらす改変を伴う形質転換体の単離は、マーカーフリー組み込みアプローチにおける一般的な問題を表します。 これは、NHEJ によって生成されるインデル変異体が過剰に増殖し、まれで成長の遅い統合形質転換体を覆い隠してしまう可能性があるためです。 工学的取り組みの失敗が公表されることはほとんどありませんが、ヤロウィア リポリティカの SDH5 遺伝子の破壊に関連した例が 1 つあります。 複数の試みにもかかわらず、この修飾は CRISPR ベースのマーカーフリー戦略を使用して単離できませんでした 13。一方、欠失は栄養要求性マーカーを使用して成功しました 14。 同様の観察は酵母工学の研究でも広く一般的であり、多くの場合、一部の遺伝子座は他の遺伝子座よりも変更が容易で、一部は失敗したままになります。これは、成長の遅い菌を選択することが難しいことも一因です。 細胞増殖に悪影響を及ぼすこのような変異は、代謝工学において頻繁に発生します15。 S. cerevisiae のゲノムワイドな研究により、遺伝子の 20% の過剰発現 16 と非必須遺伝子の 15% の破壊 17 が細胞増殖に悪影響を与えることが明らかになりました。 さらに、細胞生存率は、非対立遺伝子の修飾間のエピスタティック相互作用によって悪影響を受ける可能性があります18。 したがって、マーカーフリーの組み込みに基づく工学的アプローチには、栄養要求性マーカーに基づく厳密な選択が必要な場合（ただし予測が困難）が時折含まれる可能性があります。 このような場合、新しいカセットを再組み立てする必要があり、作業の進行が大幅に遅れます。 したがって、CRISPR/Cas9 支援統合システムに対する望ましい改善は、マーカーを使用しない試みが失敗した場合に、マーカーベースの統合に簡単に戻る方法となるでしょう。